一、樣本制備

1.1 樣本純度不足

問(wèn)題：外泌體樣本中若含有蛋白質(zhì)聚集體、脂蛋白或細(xì)胞碎片，會(huì)干擾NTA結(jié)果。

對(duì)策：

嚴(yán)格純化步驟：超速離心后建議結(jié)合密度梯度離心或尺寸排阻色譜（SEC）進(jìn)一步純化（未純化的話，會(huì)有部分跟外泌體粒徑差不多的小顆粒在檢測(cè)的時(shí)候會(huì)被計(jì)數(shù)，造成NTA檢測(cè)濃度結(jié)果偏大）。

1.2 樣本濃度不當(dāng)

問(wèn)題：濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致顆粒重疊，濃度過(guò)低則信號(hào)不足。

對(duì)策：

A.預(yù)實(shí)驗(yàn)確定稀釋倍數(shù)：NTA上機(jī)樣本最佳檢測(cè)范圍為10⁶–10⁹ particles/mL，可通過(guò)稀釋比例調(diào)整原始樣本到上機(jī)樣本。

B.稀釋液選擇：使用與樣本兼容的緩沖液（如PBS可能引起聚集，可改用0.1 μm濾過(guò)的無(wú)外泌體培養(yǎng)基或HEPES緩沖液）。

二、儀器操作

2.1 參數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤

問(wèn)題：激光強(qiáng)度、相機(jī)靈敏度或檢測(cè)時(shí)間設(shè)置不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏差。

對(duì)策：

A.根據(jù)樣本調(diào)整：高濃度樣本需降低相機(jī)靈敏度或縮短檢測(cè)時(shí)間（如15秒），低濃度樣本可延長(zhǎng)至60秒。

B.校準(zhǔn)儀器：每次檢測(cè)前用標(biāo)準(zhǔn)乳膠顆粒（如100 nm）校準(zhǔn)，確保儀器狀態(tài)正常。

2.2 樣本加載問(wèn)題

問(wèn)題：注射器殘留氣泡、樣本未混勻或進(jìn)樣量不足。

對(duì)策：

A.充分混勻樣本：輕柔渦旋或低速移液，避免劇烈振蕩導(dǎo)致外泌體破裂。

B.排除氣泡：進(jìn)樣前低速離心注射器或使用無(wú)氣泡專(zhuān)用注射器。

C.樣本檢測(cè)時(shí)間：可視界面顆粒穩(wěn)定后再點(diǎn)擊檢測(cè)分析。

三、數(shù)據(jù)分析

3.1 軟件閾值設(shè)定錯(cuò)誤

問(wèn)題：閾值過(guò)高會(huì)漏檢小顆粒，閾值過(guò)低會(huì)誤判背景噪聲。

對(duì)策：

A.手動(dòng)優(yōu)化閾值：結(jié)合動(dòng)態(tài)顆粒追蹤視頻，確保顆粒軌跡清晰且背景干凈。

B.驗(yàn)證粒徑分布：外泌體典型粒徑為30–200 nm，若出現(xiàn)大量<30 nm顆粒，可能為蛋白質(zhì)污染或儀器噪聲。

四、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案

五、其他關(guān)鍵建議

5.1 對(duì)照實(shí)驗(yàn)：

設(shè)置陰性對(duì)照（如無(wú)外泌體緩沖液）和陽(yáng)性對(duì)照（商業(yè)化外泌體標(biāo)準(zhǔn)品）。

5.2 多技術(shù)聯(lián)用：

結(jié)合電鏡（TEM）驗(yàn)證形態(tài)，WB檢測(cè)標(biāo)志蛋白（如CD63、TSG101）。

5.3 樣本保存：

避免反復(fù)凍融：分裝后-80℃保存，檢測(cè)前冰上緩慢解凍。