1.1 陽性標志物的組合驗證

      A. 外泌體特異性標志物建議選擇2-3種，如 CD9、CD63、CD81、TSG101（四萜類蛋白和ESCRT復合物成分），避免單一標志物因細胞來源差異導致誤判。

      B. TSG101 需注意其分子量可能與全細胞裂解物中的條帶位置不同，需通過預實驗確認。

1.2 陰性標志物的必要性

      須檢測 Calnexin（內質網標記） 或 GM130（高爾基體標記），若外泌體樣本中出現這些條帶，表明存在細胞器污染，外泌體純度不足。

二、樣本處理與對照設置

2.1 全細胞裂解物對比

      外泌體樣本需與來源細胞的全細胞裂解物進行WB對比，驗證標志物在外泌體中的富集程度（如CD63在外泌體中可能比細胞裂解物更顯著）。

2.2 避免蛋白降解

      外泌體樣本需分裝凍存于-80℃，避免反復凍融。提取時加入蛋白酶抑制劑，低溫操作。

2.3 樣本濃縮

      外泌體蛋白含量低，可用超濾膜濃縮或真空凍干機處理，但避免過度濃縮導致蛋白聚集。

三、實驗操作關鍵點

3.1 轉膜優化

     小分子量膜蛋白（如CD9、CD81）需使用小孔徑PVDF膜（0.22 μm），縮短轉膜時間（建議30分鐘），并采用濕轉法確保均勻性。

3.2 抗體孵育與封閉

      四萜類蛋白易因糖基化導致條帶遷移，需預實驗調整抗體稀釋度，并延長封閉時間（推薦5%脫脂牛奶封閉1小時以上）。

3.3 洗膜與背景控制

      使用含0.1% Tween-20的TBST洗膜，每次5分鐘，重復3-5次，減少非特異性結合。

四、結果分析與判斷

4.1 條帶位置異常處理

      若CD63、CD81等條帶位置偏移，可能因糖基化修飾，需裁取更寬膜范圍（如分子量±10 kDa）或改用糖基化不敏感的抗體。

4.2 陰性對照的解讀

      若Calnexin或GM130在外泌體樣本中出現微弱條帶，需重新評估提取方法（如超速離心后增加洗滌步驟）。

4.3 定量標準化

      推薦使用外泌體總蛋白量（如Bradford法）或外泌體特異性標志物（如CD9）作為內參，避免使用β-actin等細胞質蛋白。

五、通用WB陷阱規避

抗體失效：一抗/二抗工作液需現配現用，避免反復凍融。

高背景問題：檢查膜是否完全濕潤，適當降低一抗濃度（如1:1000→1:2000）。

信號弱或無條帶：增加上樣量（建議20-30 μg外泌體蛋白），或延長曝光時間。