αvβ3 integrin-specific exosomes engineered with cyclopeptide for targeted delivery of triptolide against malignant melanoma
αvβ3 整合素特異性外泌體工程改造環(huán)肽用于靶向給藥雷公藤甲素對抗惡性黑色素瘤
期刊：Journal of Nanobiotechnology
黑色素瘤是最惡性的皮膚腫瘤，難以通過化學(xué)療法、生物療法和免疫療法的替代療法治愈。先前研究表明，雷公藤甲素(TP) 對黑色素瘤表現(xiàn)出強(qiáng)大的殺腫瘤活性。然而，TP的臨床潛力受到其水溶性差、半衰期短和生物毒性的困擾。
外泌體（Exosomes, Exo）作為藥物遞送載體具有獨(dú)特的優(yōu)勢，可針對疾病特點(diǎn)進(jìn)行合理的修飾，實(shí)現(xiàn)藥物的靶向遞送，進(jìn)而達(dá)到增效減毒的目的。
結(jié)果表明：功能化的外泌體平臺為惡性黑色素瘤的靶向治療提供了有前景的策略。
EXO，CRGD-EXO和CRGD-EXO/TP的表征
cRGD-Exo/TP的內(nèi)化機(jī)制
cRGD-Exo/TP誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制
cRGD-Exo/TP的體內(nèi)生物分布和藥代動力學(xué)
CRGD-Exo/TP 的體內(nèi)生物安全性評價
從 hUC 中分離 hUCMSCs (人臍帶間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞) ，通過流式細(xì)胞術(shù)分析 hUCMSCs 表面標(biāo)志物（圖1A）；
MSC陰性標(biāo)志物CD45和CD34（在內(nèi)皮細(xì)胞和造血干細(xì)胞中的表達(dá)）的陽性率低于1%，而標(biāo)志物CD90、CD29和CD44的陽性率均在99%以上，表明培養(yǎng)細(xì)胞具備 hUCMSCs 的代表性特征（圖1B）。
結(jié)果表明：hUCMSCs成功從hUC中提取出來，表現(xiàn)出高度的增殖和自我更新能力。
EXO，CRGD-EXO和CRGD-EXO/TP的表征
采用梯度離心法純化人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體。然后在60 °C下將外泌體與自組裝膠束(DSPE-PEG2000-cRGD)共混制備 cRGD-Exo。然后將TP包埋在 cRGD-Exo 中構(gòu)建靶向給藥系統(tǒng) cRGD-Exo/TP。CRGD-Exo/TP結(jié)構(gòu)示意圖如（圖2A）所示；
透射電鏡(TEM)及動態(tài)光散射檢測到 Exo、cRGD-Exo 及 cRGD-Exo/TP 的形態(tài)及大小分布（圖2B）；
Western blot檢測到Exo和cRGD-Exo/TP中特異性標(biāo)記CD9、CD63和TSG101的表達(dá)，表明Exo成功從hUCMSCs中分離出來，且結(jié)構(gòu)cRGD插入和載藥的干擾（圖 2C）；
使用流式細(xì)胞儀檢測平均熒光強(qiáng)度 (MFI) ，當(dāng)Exo與cRGD的質(zhì)量比為1:1時，MFI最高，明顯高于Exo組（圖 2D, E）；
通過載藥量（DL）和包封率（EE）篩選cRGD-Exo與TP最合適質(zhì)量比為1:1時，cRGD-Exo/TP的EE和DL值較高（圖2F）；
（圖2G）顯示cRGD-Exo/TP在不同pH釋放介質(zhì)中72 h的藥物釋放曲線。
結(jié)果表明：cRGD-Exo/TP的釋放模式使得它是一種潛在的癌癥靶向給藥系統(tǒng)治療。
cRGD-Exo/TP的內(nèi)化機(jī)制
圖3
A375細(xì)胞與PKH26染色的Exo/TP、cRGD-Exo/TP ，HaCaT細(xì)胞與PKH26染色 cRGD-Exo/TP共孵育4小時，共聚焦結(jié)果顯示Exo成功內(nèi)化到細(xì)胞質(zhì)中（圖3A）；
半定量結(jié)果表明cRGD-Exo/TP 組的MFI顯著高于 Exo/TP 組，且A375 細(xì)胞的MFI顯著高于HaCaT 細(xì)胞（圖3B）；
證實(shí)了受體介導(dǎo)的cRGD-Exo/TP（αvβ3整合素蛋白）的細(xì)胞類型特異性內(nèi)化（與 A375 細(xì)胞相比，αvβ3 整合素蛋白在 HaCaT 細(xì)胞上低表達(dá)）。在12h時，cRGD-Exo/TP 組的細(xì)胞 TP 含量分別是 Exo/TP和TP溶液組的 1.98 倍和 1.56 倍（圖3C），這可能是由于 Exo 具有出色的生物相容性和 cRGD，指導(dǎo) cRGD-Exo/TP 特異性靶向黑色素瘤細(xì)胞中的 αvβ3 整合素。用各種抑制劑預(yù)處理細(xì)胞研究內(nèi)化機(jī)制，表明多種內(nèi)化途徑參與其中(圖3D、E)。
CCK8結(jié)果顯示 Exo 和工程化 cRGD-Exo 的細(xì)胞毒性可忽略不計(jì)，而游離 TP、Exo/TP 和 cRGD-Exo/TP 均抑制細(xì)胞增殖，cRGD-Exo/TP 的抑制作用最強(qiáng)（圖4A）；
Transwell實(shí)驗(yàn)表明 TP 、Exo/TP 和 cRGD-Exo/TP 可顯著抑制 A375 細(xì)胞侵襲，cRGD-Exo/TP 的抑制效果最強(qiáng)(圖4B, C)；
凋亡實(shí)驗(yàn)表明TP 、Exo/TP 和 cRGD-Exo/TP促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且cRGD-Exo/TP 處理的A375細(xì)胞凋亡率最高（圖4D, E）；
細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)用TP溶液、Exo/TP或cRGD-Exo/TP處理時，G0 /G1期的細(xì)胞群下降，S 期細(xì)胞增加 ，表明TP主要阻斷細(xì)胞周期的S期，從而影響有絲分裂并抑制腫瘤細(xì)胞生長（圖4F, G）。
上述結(jié)果表明：cRGD-Exo/TP 抑制A375細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)凋亡，阻斷細(xì)胞S期。
cRGD-Exo/TP誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制
細(xì)胞凋亡與死亡受體依賴性途徑（外在途徑）和線粒體依賴性途徑（內(nèi)在途徑）有關(guān)。（圖5A） 顯示 cRGD-Exo/TP 顯著增加 caspase-8 和活化 caspase-3 的表達(dá)，這表明外在途徑參與了細(xì)胞凋亡。此外，Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白如Bax和抗凋亡蛋白如Bcl-2。
Bax/Bcl-2 比率的增加可連續(xù)觸發(fā) cyto c 和 caspase-9 的表達(dá)，通過 caspase 級聯(lián)和線粒體途徑導(dǎo)致線粒體功能障礙。
此外，Survivin、VEGF和NF-κB與黑色素瘤的發(fā)生、血管生成、增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和耐藥性密切相關(guān)。survivin、VEGF和NF-κB的表達(dá)降低表明 cRGD-Exo/TP通過抑制腫瘤血管生成、細(xì)胞增殖和遷移來抑制A375細(xì)胞的生長。
TP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑示意圖。箭頭表示促進(jìn)相關(guān)蛋白表達(dá)，鈍箭頭表示抑制(圖5B)。
cRGD-Exo/TP 的體內(nèi)生物分布和藥代動力學(xué)
小鼠活體成像結(jié)果顯示兩組小鼠的熒光強(qiáng)度在4 h內(nèi)穩(wěn)定增強(qiáng)，隨后信號逐漸減弱。此外，DiR-cRGD-Exo/TP能更好地靶向并在腫瘤部位蓄積（圖6A）；
cRGD-Exo/TP處理的小鼠腫瘤組織中的熒光信號強(qiáng)于Exo/TP組（圖6B）；
兩組腫瘤組織中熒光強(qiáng)度隨時間的變化，直觀地表明cRGD-Exo/TP的保留時間更長，腫瘤靶向性更好(圖6C) ；
TP 包封在 Exo 或 cRGD-Exo 后的半衰期延長可能是由于 Exo 膜阻止了包封的藥物不及時泄漏，延遲了在血流中的消除，延長了體內(nèi)循環(huán)時間（圖6D）；
對于靶向分析，隨著時間的推移檢測腫瘤組織中的 TP 濃度，cRGD-Exo/TP 的腫瘤間 TP 積累更高（圖6E）。
結(jié)果表明：cRGD-Exo/TP能夠更好的靶向腫瘤，且保留時間更長，TP的積累更高。
動物分組和操作示意圖（7A）；
其他組相比，cRGD-Exo/TP組的腫瘤生長受到顯著抑制（圖7B-D）；
組織病理學(xué)檢查(H & E，蘇木精-伊紅染色)顯示，在 cRGD-Exo/TP 組中可以顯示腫瘤切片的病理特征，如細(xì)胞核縮小，局灶性壞死和更多的細(xì)胞質(zhì)（圖7E）；
TUNEL實(shí)驗(yàn)表明與對照、cRGD-Exo、TP 溶液和 Exo-TP 相比，用 cRGD-Exo-TP 處理后的陽性細(xì)胞（凋亡細(xì)胞、綠色熒光）顯著增加（圖7F）；
Ki67(增值指標(biāo))染色結(jié)果顯示cRGD-Exo/TP可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖（圖7G）；
Kaplan-Meier 生存曲線表明，與其他組相比，用 cRGD-Exo/TP 治療的小鼠的平均生存時間顯著延長（圖7H）。
結(jié)果表明：cRGD-Exo/TP對黑色素瘤具有顯著的抑制作用。并且經(jīng)過治療的小鼠平均生存時間顯著的延長。
CRGD-Exo/TP 的體內(nèi)生物安全性評價
考慮到 TP 治療癌癥有效且副作用嚴(yán)重，通過監(jiān)測治療期間小鼠體重變化、器官指數(shù)、正常組織 H&E 染色、血常規(guī)來評估 cRGD-Exo/TP 的生物安全性。
cRGD-Exo/TP和Exo/TP組的小鼠體重緩慢增加，與對照組和cRGD-Exo組沒有顯著差異。然而，TP溶液組的小鼠體重減輕。但是在 cRGD-Exo/TP 和對照組之間沒有觀察到器官指數(shù)的明顯變化（圖8A）；
游離TP處理小鼠的肝腎指標(biāo)明顯低于對照小鼠（圖8B）；
TP溶液組的心臟、肝臟和腎臟受損，心肌細(xì)胞擴(kuò)張并充血；肝組織出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞紊亂、空泡變性、局灶性壞死；腎小球和腎管內(nèi)皮細(xì)胞明顯異常腫脹（圖8C）；
生物安全性結(jié)果再次證實(shí)了 cRGD-Exo/TP 的體內(nèi)生物相容性，這可能有助于腫瘤靶向和在正常組織中的低分布。
作者的本次實(shí)驗(yàn),成功地從hUC 的 hUCMSCs(人臍帶間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞)中提取出EXO，并用基于αvβ3整合素的 cRGD 進(jìn)行了工程改造。cRGD-Exo 負(fù)載 TP(雷公藤素)，即 cRGD-Exo/TP(仿生靶向藥物遞送系統(tǒng) )，可以通過多種內(nèi)化途徑被 A375 細(xì)胞吸收。
此外，cRGD-Exo/TP通過擾亂半胱氨酸天冬氨酸酶級聯(lián)和線粒體通路并改變細(xì)胞周期分布，顯著抑制體外增殖、侵襲和細(xì)胞凋亡促進(jìn)。此外，體內(nèi)生物分布和藥代動力學(xué)表明，cRGD-Exo/TP具有優(yōu)異的黑色素瘤靶向能力，延長了TP的半衰期。此外，體內(nèi)抗腫瘤結(jié)果表明，cRGD-Exo/TP 顯著抑制腫瘤生長并延長荷瘤小鼠的存活時間，且生物毒性可忽略不計(jì)。
