血液中蛋白質的低穩定性和低細胞膜滲透性，需要合適的載體將蛋白質輸送到細胞中。在這里，我們報道了一種將蛋白質包封到脂質體中進行遞送的簡單一步方法。我們使用帶負電荷的超氧化物歧化酶（SOD）和多陽離子脂質體作為蛋白質和脂質體模型。通過凍融SOD-脂質體復合物（lipolexes）制備脂質體包裹的SOD。凍融過程中，脂質體中固定化SOD的數量顯著增加。令人驚訝的是，將單層脂質體冷凍-解凍產生了多層脂質體，SOD位于脂質層之間。與未凍融的脂質體相比，凍融后細胞內傳遞的SOD量顯著增加。

技術線路

1.凍融脂質體的制備及表征。

2.SOD在凍融脂質體中的固定化和封裝百分比。

3.SOD在脂質體中的定位。

4.細胞的攝取。

5.細胞內定位。

6.小鼠體內成像。

實驗結果

1.1凍融脂質體的制備

SOD是一種帶負電荷的蛋白質（pI = 5.86）；因此，我們使用帶正電荷的聚陽離子脂質體來制備脂質體。脂質體采用帶正電荷的聚陽離子脂質:DCP-Deta、DOPE和膽固醇（圖1），摩爾比為1：1：1，尺寸為100 nm。圖片 2.png

圖1

1.2質體的表征

水合脂質體作為脂質體封裝的sod的對照，水合脂質體的大小略小，表明水合脂質體中包裹的SOD與內部脂質層結合，然后脂質體大小收縮。

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表1脂質體、SOD-脂質體、凍融SOD-脂質體和水合脂質體的粒徑、多分散性指數（PDI）和zeta電位

2.1 SOD在凍融脂質體中的固定化和封裝百分比

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圖2 超氧化物歧化酶（SOD）在凍融脂質體中的固定化和封裝百分比。

(a)SOD的穩定性。將SOD（0.25 mg mL-1）凍融，并測定其活性。這些數據代表了SOD活性與未凍融實驗相比的百分比平均值±標準差（n = 4)。

(b)脂質體內固定化SOD的量。每個脂質體經超離心純化后，然后用Triton-X100溶解，最后用HPLC測定固定化SOD的量。這些數據代表了平均值±標準差(n = 4).顯著性差異；***p < 0.001與脂質體， *p <o 0.05 與脂質體， ## p <0.01與hydrated liposome.。

(c) SOD封裝百分比。每個脂質體經聚乙二醇處理將脂質體表面的SOD分離，經超離心純化。將脂質體溶解于Triton-X100中，用HPLC法測定SOD的含量。這些數據代表了平均值±標準差(n = 4).顯著性差異；***p < 0.001 與lipoplex,；### p < 0.001與hydrated liposome.。

結論：SOD在凍融處理下是穩定；凍融過程提高了脂質體的固體能力及包封。凍融脂質體是一種有效簡單的封裝蛋白質的脂質體的方法。

3脂質體與SOD的結構定位

用透視電鏡觀察Aunp（金納米顆粒）偶聯SOD制備脂質體。結果表明：可能通過冷凍過程中脂質體膜的破壞，解凍過程中隨后的重組而發生。

圖3脂質體的結構和超氧化物歧化酶（SOD）的定位。

(a)游離脂質體的(b)脂質體和凍融脂質體樣品的透射電鏡圖像。箭頭表示金納米標記的SOD。比例尺代表100納米。（d-f）脂質體、SOD-脂質體和凍融的脂質體樣品的示意圖。

4細胞攝取

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圖4由脂質體傳遞的脂質體和超氧化物歧化酶（SOD）的細胞攝取。

(a)脂質體不同劑量的細胞毒性。將結腸26NL-17細胞與各濃度的脂質體在37℃孵育24 h。然后用WST-8法檢測活細胞。這些數據代表了平均值±標準差(n = 4).

(b)每個樣本的細胞毒性。結腸26NL-17細胞分別與cy5-SOD（1 nM）、Dil-脂質體（3 mM）、SOD-脂質體（脂質體3mMSOD1nM）和凍融脂質體（脂質體3mMSOD1nM）在37 1C下孵育24 h。然后，用WST- 8法檢測活細胞。這些數據代表了平均值±標準差(n = 4).（c，d）細胞對脂質體和SOD的攝取。每個樣品都用Dil-脂質體和Cy5-SOD制備。將這些樣品加入到細胞中，孵育24小時。然后，裂解細胞，測定DiI和Cy5-SOD的熒光強度，測定(c)脂質體和(d) SOD攝取率。這些數據代表了平均值±標準差(n = 4).顯著性差異；***p < 0.001與。單獨SOD，**p<0.01與單獨脂質體，###p<0.001，#p0.05與脂質體。

結果：脂質體在濃度為3 mM時，用WST-8法檢測活細胞，顯示沒有細胞毒性；脂質體表面SOD的存在由于脂質體的高負電荷，抑制了脂質體的負電荷。然而，凍融脂質體的脂質體攝取低于游離脂質體和脂質體，因為凍融過程后脂質體的表面電荷降低，粒徑越大會減少細胞的攝取。SOD含量高，不能穿透細胞膜。而在靜電排斥力的作用下，脂質體可以有效地將SOD傳遞到膜內。此外，未凍融脂質體與凍融脂質體比，凍融脂質體細胞對凍融脂質體的SOD攝取增加了兩倍。

5細胞內定位

表明脂質體和凍融脂質體都有效地從核內體中逃逸，并且SOD在核內體逃逸后從凍融脂質體中釋放到細胞質中。

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圖5脂質體、超氧化物歧化酶（SOD）和核內體在細胞內的定位。

C26NL17細胞分別與SOD-脂質體和凍融脂質體在37 ℃下孵育24 h。然后固定細胞，用LysoTraccer（藍色）染色，用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察（綠色，SOD；紅色，脂質體；藍色，核內體）。實驗重復兩次，每次實驗拍攝3張照片。尺寸：10 μm。合并（高倍放大）顯示放大圖片中的正方形圖片。

6小鼠體內成像

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圖6尾靜脈給藥后，Cy5-SOD的體內和體外成像。將聚乙二醇化脂質體（Cy5-SOD劑量，0.2 mg kg 1）經尾靜脈注射到BALB/c小鼠體內。

(a)用體內成像系統（異種原IVIS Lumina系統）觀察Cy5-SOD的實時體內成像。

（b、c）注射24 h后收集心臟、肺、肝、脾、腎等器官，用體內成像系統觀察Cy5-SOD的熒光強度。(b)體外成像和每個器官感興趣的(c)區域。這些數據代表了平均值±標準差(n = 4)).顯著性差異；**p < 0.01，*p < 0.05與。單是SOD。

結論：SOD包裹在凍融脂質體中，阻止其與脂質體分離，顯著改變了其生物分布。這些結果表明，蛋白質封裝是一個有效的體內傳遞.

結論

建立一種利用凍融技術將蛋白質包埋成脂質體的一步法簡便方法。

在這項研究中。采用帶負電荷的SOD和帶正電荷的DCP-deda的脂質體分別作為蛋白質和脂質體模型。SOD-脂質體復合物的SOD在凍融后固定能力增加，這是由于SOD封裝在多層脂質體中的結果。雖然與非凍融脂質體相比，凍融脂質體的細胞對脂質體的攝取減少，但SOD的傳遞量顯著增加，SOD、脂質體和核內體分別定位于細胞內。在小鼠靜脈注射凍融脂質體后，SOD的封裝阻止了其脫離血液中的脂質體，導致游離SOD分布與非凍融脂質體的SOD分布不同。