Antimicrobial Effect of Extracellular Vesicles Derived From Human Oral Mucosal Epithelial Cells on Candida albicans

人口腔黏膜上皮細胞來源的胞外囊泡對白色念珠菌的抗菌作用

2022年大學醫7月，南京學院附屬口腔醫院王文梅、王翔教授研究團隊在國際知名雜志、國際免疫聯合會官方會刊Frontiers in Immunology發表研究論文“Antimicrobial effect of extracellular vesicles derived fromhuman oral mucosal epithelial cells on Candida albicans”，報道了人口腔黏膜上皮細胞來源EVs對白色念珠菌的體外和體內抗菌作用。

摘要

白色念珠菌(C. albicans)是一種共生微生物，定植于健康個體的粘膜表面。宿主或環境的改變可導致白色念珠菌的過度生長和宿主的感染，而且，白色念珠菌感染已被證明是口腔鱗狀細胞癌和口腔白斑發生發展的危險因素。

本研究的目的是評估來自人口腔黏膜上皮(Leuk-1)細胞的EV是否能抑制白色念珠菌的生長和侵襲。作者通過光學顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡、掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡評估Leuk-1-EVs對白色念珠菌的體外療效。用芽管形成率、菌絲百分率和微集落光密度分析白念珠菌在與Leuk-1細胞和EV共培養模型及抑制EV分泌后的生長情況。建立小鼠口腔念珠菌病模型，舌粘膜下注射Leuk-1-EVs。采用肉眼觀察、H&E染色、PAS染色、掃描電鏡等方法評價Leuk-1-EVs在體內的抗真菌作用（圖示）。

文獻思路

1.Leuk-1和Leuk-1-EVs的表征

作者通過超速離心從Leuk-1細胞培養上清中分離出EVs，并用NTA、透射電子顯微鏡和蛋白質印跡進行檢測。這些數據表明，作者成功的得到Leuk-1-EVs。

2.Leuk-1-EVs抑制白色念珠菌生長

作者為了評估 Leuk-1-EVs對白色念珠菌的治療效果，用不同濃度Leuk-1-EVs處理白色念珠菌。與其他組相比，高濃度EVs(120μg/ml和360μg/ml)處理組在12 h時菌絲形成明顯減少，24 h和48 h時微集落形成明顯減少，360μg/ml組比120μg/ml組抑菌效果更明顯，但在2 h時未觀察到芽管形成的顯著變化，說明Leuk-1-EVs對白色念珠菌的生長具有濃度依賴性。

這些結果表明，Leuk-1-EVs可能通過抑制白色念珠菌生長和菌絲形成發揮抗真菌作用。

3. Leuk-1-EVs誘導白色念珠菌形態學和超微結構的改變

作者通過共聚焦顯微鏡顯示，用高濃度EVs (120μg/ml 和360 μg/ml)處理后，菌絲壁上出現不規則的突起，圖中的白色箭頭表示菌絲壁上的突起。結果顯示，高濃度處理組菌絲突起明顯多于低濃度處理組和對照組。

作者用掃描電子顯微鏡下發現，未處理的白色念珠菌壁均勻光滑，實驗組發現的孢子較多，菌絲突出更明顯。結果還顯示，實驗組白色念珠菌的孢子和菌絲突出多于對照組，這些具體變化用圖中的黑色箭頭表示。

結果表明，實驗組白色念珠菌的孢子和菌絲突起多于對照組。 

在透射電子顯微鏡中，未經處理的白色念珠菌細胞壁光滑完整，細胞質均勻，細胞器完整。相比之下，高濃度處理組，白色念珠菌胞漿密度不均勻(圖中綠色箭頭)、細胞壁上粘液蛋白增加(圖中黑色箭頭)和細胞壁突出(圖中棕色箭頭)、細胞壁不完整(圖中紅色箭頭)、細胞膜內卷(圖中黃色箭頭)、明顯腫脹的線粒體、細胞器腫脹和細胞質不均(圖中紫色箭頭)。作者還分析了兩組白色念珠菌細胞壁的平均密度和厚度。結果顯示，實驗組細胞壁平均IOD(4.37±0.33)顯著低于對照組(10.09±0.51)，實驗組細胞壁平均厚度(230.76±11.35 nm)顯著高于對照組(99.28±7.94 nm) 。

這些結果進一步表明，Leuk-1-EVs可能通過誘導破壞細胞壁完整性和細胞器結構的損傷發揮抗真菌作用。

4. GW4869減弱Leuk-1-EV對白色念珠菌生長的抑制作用

GW4869是nSMases(也稱為SMPD2和SMPD3)的特異性抑制劑，已被證明可以抑制細胞外泌體的釋放。作者為了篩選GW4869的最佳濃度，用CCK-8法測定了不同濃度GW4869處理的Leuk-1細胞的存活率，高濃度GW4869(10μM和20μM)處理的細胞活力顯著低于其他各組(分別為81.44%和56.70%)。因此，最佳培養濃度設置為7.5μM。作者為了研究EVs釋放量降低對Leuk-1細胞抗白色念珠菌活性的影響，作者評估了在與GW4869共培養的Leuk-1細胞后，白色念珠菌生殖管、菌絲和微菌落的形成。作者在抑制Leuk-1細胞外泌體分泌2h后，顯微鏡下觀察白念珠菌的芽管、菌絲(12h)和菌落(24h和48h)的形成。

結果表明，與對照組相比，白色念珠菌+Leuk-1組和白色念珠菌+Leuk-1+GW4869組的胚管形成率顯著降低。根據光密度分析結果發現白色念珠菌+Leuk-1+GW4869組菌絲和小菌落的光密度高于白色念珠菌+Leuk-1組。

結果表明，EVs釋放的減少會影響Leuk-1對白色念珠菌的抗真菌作用。

5.Leuk-1-EVs 和 Leuk-1 細胞協同抑制白色念珠菌的生長

在顯微鏡下觀察到Leuk-1細胞和Leuk-1-EVs協同作用下白色念珠菌的胚管、菌絲和微菌落的形成情況，發現白色念珠菌+ Leuk-1組和白色念珠菌+ Leuk-1 + EVs組的胚管形成率顯著低于白色念珠菌組，通過菌絲和微菌落光密度分析結果為白色念珠菌+ Leuk-1+ EVs組均低于其他組。

這些結果進一步表明，Leuk-1-EVs可以通過協同抑制白色念珠菌的生長來增加 Leuk-1細胞的抗真菌作用。

6. Leuk-1-EVs治療可減輕小鼠口腔念珠菌病

作者構建了口腔念珠菌病小鼠模型，通過對小鼠舌內進行注射Leuk-1-EVs治療后，白色念珠菌+ EVs組的白色病變評分顯著降低。

結果表明，Leuk-1-EVs的治療可以通過減輕口腔黏膜的白色念珠菌感染而在體內發揮抗真菌作用。

7.Leuk-1-EVs治療減少白色念珠菌誘導的口腔黏膜炎癥

作者通過口腔黏膜組織病理學H&E染色發現白色念珠菌+EVs組可見正常的絲狀乳頭，白色念珠菌+ EVs的炎癥細胞明顯減少，炎癥細胞浸潤強度明顯低于白色念珠菌組，還通過PAS染色結果發現白色念珠菌組舌粘膜中的菌絲比白色念珠菌+EVs組的多且絲狀乳頭消失。與白色念珠菌組相比，白色念珠菌+EVs組菌絲侵襲程度顯著降低。

這些結果表明，通過Leuk-1-EVs的治療可以減少及抑制白色念珠菌誘導的口腔粘膜炎癥和侵襲。

8.Leuk-1-EVs治療可抑制口腔黏膜白色念珠菌的侵襲

掃描電子顯微鏡與PAS染色結果一致，顯示白色念珠菌組舌背的白色念珠菌菌絲多于白色念珠菌+EVs組，白色念珠菌組還可以觀察到生物膜和角蛋白脫屑。通過菌絲和孢子數量分析還表明，白色念珠菌組明顯多于白色念珠菌+EVs組。

結果表明，Leuk-1-EVs治療可以通過限制白色念珠菌菌絲侵入口腔黏膜來發揮抗真菌作用。

 結論

在本文研究中，Leuk-1-EVs不僅抑制了白色念珠菌的生長，而且誘導了白色念珠菌的超微結構改變和損傷。作者的結果還表明，Leuk-1 EVs對口腔念珠菌病小鼠模型具有抗真菌作用，可減輕白色念珠菌的感染和侵襲。深入了解口腔黏膜上皮細胞衍生的EVs與白色念珠菌之間的特異性相互作用，將有助于制定涉及EVs治療念珠菌病的策略。

文獻鏈接：DOI: 10.3389/fimmu.2022.777613