摘要

三磷酸核苷二磷酸水解酶 2 (NTPDase2) 是 E-NTPDase 家族的八個成員之一（表示為 NTPDase1 至 8）。 NTPDase1、NTPDase2、NTPDase3 和 NTPDase8 是質(zhì)膜的整合蛋白 ，它們協(xié)同作用水解細胞表面的核苷酸。但每一種都表現(xiàn)出不同的親和力和能力，這些差異導(dǎo)致 P2 受體和相關(guān)功能的不同激活 。 NTPDase2 能有效地水解三磷酸核苷( ATP , UTP),但對二磷酸衍生物的水解卻很差 。這些生化特征分別促進了附近的 ADP 和 UDP 轉(zhuǎn)導(dǎo)受體如 P2Y1 和 P2Y6 的激活。

動物模型中的大量研究表明，NTPDase2 調(diào)節(jié)整個身體的關(guān)鍵細胞間信號傳導(dǎo)過程。例如，NTPDase2 在血管外膜細胞表面表達，在此，它被認為通過促進血小板上 ADP 受體（ P2Y1 和 P2Y12 ）的激活而在血管完整性中發(fā)揮作用 。 NTPDase2 也由 1 型味蕾細胞表達 ，它參與味覺轉(zhuǎn)導(dǎo) 。 NTPDase2 的其他建議功能包括促進非洲爪蟾的眼睛形成而不是小鼠、調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育 和調(diào)節(jié)大鼠膽管上皮細胞的增殖 。 NTPDase2 也位于腎臟內(nèi)的 Bowman 囊中，但其功能尚未確定 。盡管最近開發(fā)的 NTPDase2 KO 小鼠將有助于識別 NTPDase2 的功能，但 NTPDase2 的研究，特別是在人類中的研究，仍然受到缺乏工具的阻礙。

技術(shù)線路

文獻思路

1.人NTPDase單克隆抗體的產(chǎn)生和表征

之前嘗試使用 cDNA 免疫產(chǎn)生單克隆抗體沒有成功。因此，我們通過 HEK 293T 細胞瞬時轉(zhuǎn)染表達人 NTPDase2 蛋白的進行加強免疫，從而提高抗體的效價。該程序是用下列小鼠進行的，第三次注射后12天收集的血清在非還原條件下通過蛋白質(zhì)印跡測定具有最高滴度。從脾中收集的 B 細胞與骨髓瘤細胞融合，未純化的雜交瘤細胞的上清液通過 ELISA 進行測試，篩選出未亞克隆的8個雜交瘤細胞。雜交瘤細胞通過連續(xù)的稀釋重復(fù)亞克隆，以確保選擇的克隆是純的，并通過ELISA技術(shù)鑒定進一步檢測選出最好的4個細胞株（hN2-B2s、hN2-D5s、hN2-H9s和hN2-H10s）。如圖1 .我們進行了 ELISA 測定確定這些單克隆抗體的同種型，并發(fā)現(xiàn)四種雜交瘤均產(chǎn)生 IgG2b。

圖1：鑒定產(chǎn)生抗NTPDase2抗體的雜交瘤。

通過ELISA用人NTPDase2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（實心條）或未轉(zhuǎn)染（空心條）的COS-7細胞測試雜交瘤的上清液，并在450nm處測量吸光度。 左側(cè)的組顯示了在第一次篩選后從雜交瘤（未克隆）收集的上清液獲得的一些代表性數(shù)據(jù)，右側(cè)的數(shù)據(jù)組顯示了在重復(fù)克隆每個陽性雜交瘤后在克隆上獲得的測量值。 產(chǎn)生檢測人 NTPDase2 的抗體的雜交瘤被鑒定為克隆 B2s、D5s、H9s 和 H10s

結(jié)論：用來轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染編碼人 NTPDase2 的質(zhì)粒的 COS-7 細胞的裂解物通過蛋白質(zhì)印跡測試四種人 NTPDase2 的單克隆抗體。

圖2 通過蛋白質(zhì)印跡和免疫細胞化學(xué)檢測小鼠單克隆抗體對人 NTPDase2 的特異性。

如圖2a所示，四種單克隆抗體僅在非還原條件下特異性識別人NTPDase2。 事實上，在存在 β-巰基乙醇的情況下沒有檢測到信號。如圖 2b，在來自 COS-7 細胞的裂解物上測試這些單克隆抗體與其他 NTPDases 的質(zhì)膜整合蛋白（即 NTPDase1、-3、 -8）潛在交叉反應(yīng)性，及表達小鼠和大鼠 NTPDase2 的質(zhì)粒。如圖 2c 所示，hN2-D5s 沒有與向相關(guān) NTPDases 發(fā)生反應(yīng)如圖2c。其他三種單克隆抗體也獲得了類似的結(jié)果。四種單克隆抗體（ hN2-B2s、hN2-D5s、hN2-H9s 和 hN2-H10s ）用轉(zhuǎn)染人 NTPDase2 的 COS-7 細胞做免疫細胞化學(xué)，其結(jié)果均為陽性，在未轉(zhuǎn)染的 COS-7 上都沒有檢測到信號（圖2d）

圖3 流式細胞儀檢測小鼠單克隆抗體對人 NTPDase2 的特異性

對未轉(zhuǎn)染的 HEK 293T 細胞 (293 non tf) ， hN2-D5s、hN2-B2s、hN2-H10s ， hN2-H9s ，同種型對照 (IgG2b) 孵育的人、小鼠或大鼠 NTPDase2 細胞進行流式細胞術(shù) 濃度為 1 μg/mL。四個單克隆抗體對人 NTPDase2 具有特異性（偏差值在70%以上），轉(zhuǎn)染小鼠或大鼠 NTPDase2 的 HEK 293T 細胞上未檢測到變化，用其他三種單克隆抗體獲得了類似的結(jié)果。

圖4 hN2-D5s 特異性抑制人 NTPDase2

其中一種單克隆抗體將人 NTPDase2 的 ATPase 活性降低了一半（圖 4a)。在 Ringer 緩沖液、Tris-Ca緩沖液和 Tris-Mg緩沖液中測試了hN2-D5s 的抑制作用。在 Ringer 和 Tris-Ca 緩沖液抑制率相近。而Tris-Mg 緩沖液中對人 NTPDase2 的抑制率略低（圖4b）。然后選擇林格緩沖液用于測定：對表達不同種屬NTPDaes的細胞裂解液進行所有活性測試。 hN2-D5s 與來自其他人 NTPDases（NTPDase1、-3 和 -8）和不同物種 NTPDase2（小鼠，大鼠）的細胞裂解物一起孵育時，沒有檢測到抑制作用，但 hN2-D5s抗體和同種型對照存在下，抑制百分比是有抑制的。hN2-D5s抗體還具有阻斷位于細胞表面的人NTPDase2活性的能力（圖4d）。

2.人NTPDase多克隆抗體的產(chǎn)生和表征

通過 cDNA 免疫三只兔子產(chǎn)生了針對人 NTPDase2蛋白多克隆抗體（ hN2-1l、hN2-2l 和 hN2-3l ）。分別在第四次 (I4) 和第五次注射 (I5) 后收集血清，分裝并在 -80 °C 下與 10% 甘油一起儲存。 這些抗體的特異性通過下文詳述的技術(shù)進行測試。

首先使用轉(zhuǎn)染細胞的裂解液在非還原條件下通過蛋白質(zhì)印跡檢測抗人 NTPDase2 的多克隆兔血清。免疫血清hN2-3LI5（圖5a），hN2-2LI5也獲得了強陽性反應(yīng)。 hN2-1LI5 血清的信號較弱。至于單克隆抗體，多克隆抗體在還原條件下不識別人NTPDase2蛋白。然后通過免疫細胞化學(xué)對這三只兔子的血清進行檢測，未轉(zhuǎn)染的COS-7細胞，表達人 NTPDase2 的COS-7xibao 為樣本，結(jié)果： hN2-3LI5 與轉(zhuǎn)染人 NTPDase2 的 COS-7 細胞反應(yīng)陽性，未轉(zhuǎn)染的COS-7細胞，陰性血清均為陰性。而hN2-2LI5 和 a與 hN2-1LI5 的反應(yīng)較弱。非轉(zhuǎn)染的細胞與免疫血清一起孵育，hN2-2LI5 抗血清得到了相似的結(jié)果，hN2-1LI5 觀察到了較弱的陽性信號。

圖5 通過蛋白質(zhì)印跡、免疫細胞化學(xué)和流式細胞術(shù)檢測兔多克隆抗血清 hN2-3LI5 對人 NTPDase2 的特異性

在非還原條件 (N.R.)（左圖）或還原條件（紅色）（右圖）中孵育的用編碼人 NTPDase2 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的 COS-7 細胞的裂解物（一個大孔 120 μg）的蛋白質(zhì)印跡 與兔多克隆抗人 NTPDase2 抗體 hN2-3LI5 或其免疫前血清（均為 1:500）。 b 在未轉(zhuǎn)染的 COS-7 細胞（左圖）或用人 NTPDase2 編碼質(zhì)粒（右圖）轉(zhuǎn)染并用 hN2-3LI5（上圖）或其免疫前血清（下圖）（均為 1:500）探測的免疫細胞化學(xué) . 比例尺代表 25 μm。 c 對未轉(zhuǎn)染的 HEK 293T 細胞（293 non tf）或用 hN2-3LI5（上圖）或其免疫前血清（下圖）孵育的人 NTPDase2 細胞轉(zhuǎn)染的流式細胞術(shù)（下圖）（均為 1:100）

3．單抗和多抗的免疫組化及免疫熒光

這些單克隆和多克隆抗體在人體腸道上通過免疫組織化學(xué)測試，以確定表達 NTPDase2 的細胞。 圖6 顯示單克隆抗 hN2-H9s和兔多抗hN2-2LI5在冷凍切片（圖6a）和石蠟切片（圖6b）均檢測到人結(jié)腸神經(jīng)結(jié)構(gòu)中存在NTPDase2蛋白，盡管后者的反應(yīng)較弱。 在冷凍切片中，用其他三個雜交瘤和另外兩個兔血清獲得了類似的結(jié)果。在石蠟切片中，hN2-H9s 的反應(yīng)最強烈，其次是 hN2-D5s 和 hN2-B2s，hN2-H10s)未獲得信號。

為了確定 NTPDase2 存在于神經(jīng)元細胞或周圍的神經(jīng)膠質(zhì)細胞中，分別使用神經(jīng)膠質(zhì)細胞標(biāo)記物 SOX10 和神經(jīng)元標(biāo)記物 Hu C/D對人空腸的整個腸肌間叢進行共定位實驗。將兔體內(nèi)產(chǎn)生的抗SOX10抗體與抗NTPDase2單克隆抗體進行雙重染色，并用兔NTPDase2抗血清檢測小鼠的Hu C/D抗體。圖6c結(jié)果表明NTPDase2蛋白由人空腸中神經(jīng)結(jié)構(gòu)周圍的神經(jīng)膠質(zhì)細胞表達。

圖6 NTPDase2 在人腸道中的免疫定位

使用單克隆抗體 hN2-H9s（上圖）或多克隆抗體 hN2-2lI5（下圖）在冷凍切片 (a) 或石蠟 (b) 人結(jié)腸或人空腸肌間叢 (c) 中定位人 NTPDase2。 IgG2b 無關(guān)抗體和免疫前血清 (hN2-2lPi) 用作陰性對照。 c 膠質(zhì)細胞標(biāo)志物 SOX10 和神經(jīng)元標(biāo)志物 Hu C/D 用于共定位。 用蘇木精水溶液 (a) 對細胞核 (藍色) 進行復(fù)染。 比例尺代表 20 μm (a, b) 和 100 μm (c)

實驗結(jié)果

總之，我們已經(jīng)產(chǎn)生了三種兔抗血清和四種雜交瘤（至少有兩種是不同的），它們產(chǎn)生了針對人 NTPDase2 的 IgG2b 抗體。本研究中產(chǎn)生的抗體至少對于蛋白質(zhì)印跡、流式細胞術(shù)、免疫細胞化學(xué)和非還原條件下的免疫組織化學(xué)是特異性和有效的。這些抗體對人 NTPDase2 具有高度特異性，因為它們不與任何其他相關(guān)的 NTPDases 發(fā)生交叉反應(yīng)。此外，一種雜交瘤 hN2-D5s 產(chǎn)生了一種特異性抑制人 NTPDase2 的抗體。總之，我們已經(jīng)生成了強大的工具來研究人類 NTPDase2。